Principios y aplicaciones de la Genética Forense

February 11, 2012 26276
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El ADN en el Laboratorio El ADN en el Laboratorio Gentest 2010

La identificación humana ha sido uno de los principales aspectos que interesan los humanos desde diversas áreas del conocimiento; la filiación y el sentido social y  de pertenencia a determinado grupo de persona, nos convierte en una de las especies animales que más interacciones ecológicas puede presentar en la biosfera. Son diversos puntos de interés que versan sobre la identificación y la filiación humanas, pero principales en el objeto de estudio es el hecho de atribuir diversas características que van de lo general a lo particular, atribuyendo en cada nivel diversas estructuras, formas, tamaños, colores, pensamientos, ideas, nombres y por supuesto el nivel biológico.

El avance tecnológico y científico ha permitido que a lo largo del tiempo, el humano cuente con herramientas que le permitan brindar una certeza al proceso de la identificación  y la filiación; y han sido diversos momentos en la historia en los que se ha alcanzado, aparentemente, un tope máximo en el uso de la tecnología y la ciencia para este fin; pongamos por ejemplo, los procesos de comparación fenotípica que se realizan por parte de los médicos o parteras cuando se ponía en duda la relación biológica de paternidad, con el simple parecido o no se podía brindar algún tipo de certeza a las personas; o la observación de malformaciones que eran heredadas por alguno de los progenitores.

 

Sin embargo, con los resultados obtenidos en el caso del joven de Ghana, cuyo padre no estaba disponible, se pudo deducir que pertenecía al entorno familiar de su supuesta madre, pero no se podía resolver si era su hijo biológico o su sobrino. El Ministerio de Interior británico solicitó la colaboración de Alec Jeffreys, profesor de Genética de la Universidad  de Leicester, que acababa de publicar la posibilidad de aplicar el análisis de determinadas regiones repetitivas y muy polimórficas del ADN a cuestiones de identificación humana, incluidos los estudios de filiación (5,6)

Mediante el análisis de la huella genética del joven y de sus presuntos madre y tres hermanos pudo confirmarse la maternidad. Un año más tarde, esta tecnología se aplicó por primera vez a un caso criminal abierto en el Reino Unido por violación y asesinato de dos jóvenes en 1983 y 1986 en el condado de Leicester y en el que la prueba del ADN no sólo contribuyó a la identificación del culpable sino también a demostrar que la confesión del hombre inicialmente detenido y acusado de los crímenes era falsa (7).

Desde ese tiempo, la prueba pericial en materia de Genética Forense ha servido para la administración y aplicación de Justicia en diversas latitudes y México no es la excepción. Este prueba en nuestro sistema de justicia, está revolucionando la forma en la que se aplicaban los procedimientos criminalísticos y en la que los jueces interpretan la prueba pericial, ya que al tratarse de una prueba vinculante ofrece el medio necesario para que se identifique con una certeza científica el perfil genético de un presunto responsable en un delito contra la libertad sexual o se determine de manera específica la relación biológica de parentesco de tipo paternidad entre un supuesto padre y un supuesto hijo. 

 

Desde una aplicación forense, este perfil genético puede utilizarse para dos aplicaciones fundamentales: la determinación biológica de parentesco o la identificación humana en investigaciones judiciales. La primera de ellas, establece que la constitución genética de un individuo es resultado de la herencia genética obtenida de los progenitores, por lo que la perfilación genética nos ayuda a establecer cuál de esos dos marcadores tiene un origen paterno y el otro materno. En el caso de la identificación, la total correspondencia del perfil genético de un sospechoso con el perfil genético de un indicio recuperado en el lugar de los hechos deber ser total para cada marcador genético analizado y comparado.

Debido a que el ADN se puede encontrar prácticamente en cualquier sustrato biológico que contenga células (excepto los eritrocitos); los procedimientos en el laboratorio han cambiado de tal forma que es posible realizar la obtención de un perfil genético de identificación de elementos encontrados en el lugar de los hechos tales como colillas de cigarros, gomas de mascar, gotas pequeñas de sangre, cabellos, rastros de semen, manchas de saliva, etc.

Son principalmente cuatro fases las que se siguen en el laboratorio de Genética Forense para la obtención del perfil genético, aunque es menester resaltar que un buen trabajo en el laboratorio depende en su mayor parte de un correcto trabajo que se haga de criminalística de campo, es decir, se tienen que aplicar correctamente los métodos de colectar y resguardo de todas y cada una de las muestras biológicas recolectadas en el lugar, de manera que se conserven la mayor cantidad de células hasta su llegad al laboratorio. 

 

La primera fase analística en el laboratorio, una vez que se han recibido en cadena de custodia las muestras, es la valoración (Figura No. 5) Aún y cuando en la actualidad se cuenten con herramientas técnicas que permiten el procesamiento adecuado de las muestras, los indicios biológicos trabajados en el ámbito forense suelen ser las más complicadas, ya que se presentan en condiciones contrarias, no conservadas, afectadas por inclemencias del tiempo, contaminación bacteriana y otros que demeritan la calidad de la célula y por lo tanto degradan el material genético. Por lo que una valoración en el laboratorio permitirá conocer el estado de las células, su cantidad, la calidad del ADN y otras características.

Una vez que se ha valorado la muestra, se procede al segundo paso denominado extracción en microcantidades; este proceso permite obtener el ADN en suspensión y eliminar los componente celulares como membranas y organelos que impiden el análisis de la secuencia. Dada la naturaleza de cada muestra se tienen a disposición diversos sistemas manuales y automatizados que permiten la extracción del material genético, que van desde las más clásicas como la extracción orgánica con fenol, cloroformo, alcohol isoamílico hasta sistemas con resinas magnéticas o resinas quelantes que permiten obtener un gran porcentaje de eficiencia de extracción. Dichos sistemas con la integración en la solución de extracción de buffers de lisis o de extracción y proteinasas además de sistemas automatizados, permiten manipular varias muestras en un mismo proceso y reducir considerablemente el tiempo en el laboratorio. Posteriormente a la extracción, la cuantificación del ADN humano es el paso siguiente, el cual tiene por objeto determinar la cantidad que existe en suspensión de la extracción en el paso anterior, este punto es crítico ya que la amplificación por PCR requiere de una medida aproximada de la cantidad de ADn que será utilizada en la mezcla de reacción. Existen diversos sistemas para lograr la cuantificación, como el extinto Quantiblot ® que mediante una sistema de blot permitida cuantificar por colorimetría la cantidad de ADN presente al hacer reaccionar la muestra con una sonda especial humana marcada; aunque el sistema que actualmente se utilizar es mediante PCR en tiempo real con el sistema Aluquant ®.

Muchos de los vestigios biológicos de interés forense (Figura No. 6) presentan cantidades muy pequeñas de ADN o un ADN muy deteriorado, por lo que no son susceptibles de ser analizados mediante análisis de RFLPs. Para estos casos resulta de gran utilidad el uso de la técnica de amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction), descubierta por Kary Mullis en 1985. Esta técnica ha supuesto una auténtica revolución en el mundo de la Biología Molecular, lo que le valió a su inventor el premio Nobel en 1993. La introducción de la PCR en Genética Forense ha hecho posible el análisis de una gran variedad de muestras cuyo estudio resultaba imposible mediante las técnicas convencionales.

La PCR permite la obtención in vitro de millones de copias de un fragmento de ADN específico a partir de una cantidad ínfima de ADN (de hasta picogramos) mediante una reacción enzimática cíclica. Los componentes básicos en un mezcla de reacción de PCR (Figura no. 7)  son: el ADN molde extraído a partir de la muestra biológica, un par de oligonucleótidos o cebadores (pequeños fragmentos de ADN de cadena simple de secuencia complementaria a las regiones que flanquean al segmento de ADN de interés) en ese caso los marcadores genéticos o STR´s; que mediante su unión específica al ADN molde permiten iniciar la reacción, la polimerasa (enzima que cataliza la reacción), nucleótidos (que servirán de sustrato con los que  sintetizar las nuevas cadenas de ADN), incluso esta última obtenida ya mediante procesos de  ingeniería genética, lo cual abarata el costo del proceso y además del tampón y las sales necesarios para el óptimo funcionamiento de la enzima.(10)

 La PCR se fundamenta en algunas de las propiedades del ADN ya mencionadas;  Un proceso estándar de PCR implica la repetición de un número determinado de ciclos, cada uno de los cuales consta de tres pasos:

a) Desnaturalización: mediante elevación de la temperatura a 90-95 º C las dos cadenas de la doble hélice de ADN molde se separan, quedando en forma de cadena simple.

b) Hibridación: al disminuir la temperatura a 50-65 ºC, los cebadores se unen al ADN molde justo en el lugar de sus secuencias complementarias (su pequeño tamaño favorece esta unión frente a la posibilidad de renaturalización o unión de la cadena complementaria de ADN molde).

c) Extensión: el calentamiento a 72 °C (temperatura óptima de funcionamiento de la polimerasa), permite la extensión de la cadena de ADN a partir de los cebadores mediante la adición sucesiva de nucleótidos tomando como referencia la secuencia del ADN molde. Estos tres pasos se repiten cíclicamente entre 25 y 35 veces, de forma que el proceso total de la reacción dura aproximadamente 3 horas.

Con las metodologías actuales se pueden realizar amplificaciones múltiples, mediante sistemas que contienen 13, 16 o más marcadores genéticos y que pueden generarse los ciclos necesarios para obtener los perfiles genéticos de varias muestras al mismo tiempo. Ello ha supuesto un gran esfuerzo conjunto por parte de la comunidad científica genético-forense y de las casas comerciales para el desarrollo, puesta a punto y validación de kits de reacción de PCR optimizados para obtener el máximo rendimiento de la mínima cantidad de ADN, lo que se ha traducido en una disminución importante en la cantidad de ADN molde requerida, factor muy importante en muestras mínimas.

Las implicaciones metodologías de está técnica han sido valoradas por muchos laboratorios de Genética Forense a nivel nacional e internacional, y de igual forma como se comentó el trabajo en campo, el trabajo en laboratorio debe de cumplir con cierta normatividad que asegure que el proceso desde la extracción hasta la obtención del perfil genético se realizar bajo las más estrictas normas de calidad y donde se tenga la certeza de que procesos de contaminación cruzada no se van a presentar, delimitando bien los espacios físicos de extracción, amplificación y secuenciación dentro de las instalaciones.  En el laboratorio de ADN forense, a menudo se trata con vestigios biológicos que están lejos de ser la muestra ideal, tanto en lo que se refiere a su cantidad como a su calidad. No debemos olvidar que, aunque la PCR ha supuesto una revolución en biología forense, presenta una serie de limitaciones que a veces son muy difíciles de salvar. Estas limitaciones se refieren principalmente a las posibilidades de: a) degradación, propia de muestras antiguas, putrefactas, procedentes de cadáveres en descomposición o aquellas sometidas a condiciones ambientales adversas y en las que el ADN se encuentra muy fragmentado, lo cual dificulta o impide la obtención de fragmentos de ADN del tamaño esperado; b) inhibición de la reacción de PCR por la presencia de determinadas sustancias como tintes textiles, altas concentraciones de melanina o hemoglobina en el extracto de ADN u otras, que bloquean a la polimerasa impidiendo la amplificación; c) modificación del ADN, consistente en la existencia de enlaces covalentes intra o intercatenarios, depurinización o roturas que hacen al ADN no susceptible de ser amplificado y que pueden deberse a la conservación de cada muestra.

El cuarto y último paso en este procedimiento es la secuenciación; dicho procedimiento consiste en la lectura de las muestras amplificadas en el proceso de PCR para la obtención de los perfiles. Dicho proceso puede realizarse de dos formas básicas, una secuenciación manual mediante geles de poliacrilamida y una secuenciación automatizada mediante un secuenciador. El primer proceso involucra la separación por carga y pesos moleculares dentro de una matriz de poliacrilamida, para después ser tenidos por nitrato de plata o fluorescencia. La secuenciación automática involucra el marcado con fluorocromos cada base nitrogenada para que puedan ser detectadas las longitudes de onda mediante un lector laser y se transforma a un electroferograma.

Es importante señalar, que la automatización provee de un mejor sistema de trabajo en laboratorios con una gran cantidad de muestras a procesar ya que dependiendo del modelo de secuenciador se pueden trabajar de manera simultánea hasta 96 muestras, reduciendo considerablemente el tiempo de obtención de los perfiles genéticos.

Actualmente existen miles de STRs identificados y se calcula que en el genoma humano existe un STR cada 10 000 pares de bases. Entre los distintos tipos de STRs, los más comunes con fines forenses son aquellos cuya repeticiones constan de cuatro nucleótidos o cinco. Estos presentan la ventaja, frente a aquellos con unidades de repetición menores (dos o tres nucleótidos), de una mejor resolución entre alelos de tamaño próximo en individuos heterocigotos, así como una reducción en la formación de bandas fantasmas en la PCR. En los criterios a seguir para la selección de STRs con aplicación en identificación humana deben primar los siguientes factores: alto poder de discriminación, alta heterocigosidad, localización en distintos cromosomas  para evitar el ligamiento entre marcadores, robustez y reproducibilidad de resultados en reacciones múltiplex, baja tasa de mutación y longitud de alelos en el rango de 90-450 pares de bases.

Para un intercambio y comparación de resultados efectivo entre distintos laboratorios es necesaria la utilización de una batería de marcadores genéticos comunes. Actualmente, los marcadores más extendidos a nivel mundial son los 13 STRs autosómicos integrados en el sistema CODIS (Combined DNA Index System) establecido en 1997 por el FBI para la creación de un banco de datos nacional. La probabilidad de coincidencia al azar entre individuos no relacionados mediante el análisis de los 13 marcadores del CODIS es inferior a uno en un billón; o también el sistema Power Plex 16 ® de Promega Corporation que  es utilizada como una base de datos en diferentes países latinoamericanos incluido México, y que permite un poder de discriminación superior a 1 en 2 X 10 17.

BIBLIOGRAFIA

 

1.       BEAS C., ORTUÑO, D. ARMENDÁREZ J.: (2009) Biología Molecular, fundamentos y aplicaciones. Editorial McGraw Hill. 17 – 33.

2.       BUTLER J,M. (2001). Forensic DNa Typing. Biology and Technology behind STR markers. Academic Press. 13- 39; 135 – 192.

3.       FARFÁN M.J. (2006) Introducción a la tecnología del ADN aplicado al laboratorio forense. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla. 1 – 23.

4.       GILL P., WERRETT D.J.: (1987) Exclusion of a man charged with murder by DNA fingerprinting. Forensic Sci. Int. 35: 145-148.

5.       GUTIERREZ C. A. (1999). Manual de Ciencias Forenses y Criminalística. Editorial Trillas. México. 25 – 45.

6.       JEFFREYS A.J, WILSON V., THEIN S.L.: (1985) Hypervariable ‘minisatellite’ regions in human DNA. Nature 314: 67-73.

7.       JEFFREYS A.J., WILSON V., THEIN S.L.: (1985) Individual-specific ‘fingerprints’ of human DNA. Nature 316: 76-79.

8.       JEFFREYS A.J., BROOKFIELD J.F., SEMEONOFF R.: (1985) Positive identification of an immigration test-case using human DNA fingerprints. Nature 317: 818-819.

9.       NOVO, F. (2007). Genética Humana, Conceptos, mecanismos y aplicaciones de la genética en el campo de la biomedicina. Editorial Pearson Prentice Hall. 93 – 102.

10.   MULLIS K.B., FALOONA F.A.: (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155: 335-350.

11.   WATSON J.D., CRICK F.H.: (1953) Molecular structure of nucleic acids; a structure for desoxyribose nucleic acid. Nature 171: 737-738.

 

Last modified on Saturday, 15 September 2012 08:47
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